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Schémas d’incisions et de fracture des différents morphotypes de dents adaptés au recueil de pulpes dentaires et à l’analyse d’ADN

Incision and fracture of different morphotypes of teeth suitable for recovery of dental pulp and for DNA analysis
A.-M. Grimoud, C. Keyser, L. Calvo et B. Pajot

Résumés

Les facteurs de risques de contaminations croisées des échantillons de tissus destinés à l’étude de l’ADN ancien sont nombreux. La pulpe dentaire étant mieux protégée mais en faible quantité, nous avons mis au point une technique de fracture des différents morphotypes de dents qui nous permet de recueillir la totalité de la pulpe dans des conditions aseptiques.

Incision and fracture of different morphotypes of teeth suitable for recovery of dental pulp and for DNA analysis

There are numerous risk factors for cross-contamination of tissue samples for DNA. As dental pulp is better protected but small in amount, we have developed a fracture technique for the different dental morphotypes which allows the total recovery of the pulp in aseptic conditions.

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Texte intégral

Introduction

1Parmi les échantillons dont on dispose pour étudier l’ADN ancien, la dent représenterait une source d’ADN à l’abri des contaminations croisées (Brown, Brown, 1992 ; Hänni, 1994). Ainsi en médecine légale, pour des personnes décédées depuis trois mois à vingt ans, le meilleur outil génétique est l’ADN dentaire (Ginther et al., 1992). L’étude des pulpes dentaires permet la recherche d’ADN mitochondrial (Ohira, Yamada, 1999) et nucléaire (Schwartz et al., 1991 ; Woodward et al., 1994 ; Garcia et al., 1996 ; Ohira, Yamada, 1999 ; Pfeiffer et al., 1999 ; Sivagami et al., 2000), mais également la recherche d’agents pathogènes (Drancourt et al., 1998 ; Raoult et al., 2000).

2Le recueil des échantillons relève d’un protocole strict, excluant tout risque de contamination. Différents modes de recueil sont décrits, il s’agit essentiellement de dents broyées, sectionnées, ou trépanées (Hänni et al., 1990 ; Di Benedetto et al., 2000 ; Baker et al., 2001 ; Pfeiffer et al., 1999 ; Hummel et al., 1999 ; Burger et al., 1999 ; Garcia et al., 1996 ; Drancourt et al., 1998 ; Raoult et al., 2000). Par ailleurs les recherches sur la protection de l’ADN fourni par les tissus durs de la dent ne portent que sur de l’ADN récent (Schwartz et al., 1991 ; Garcia et al., 1996 ; Baker et al., 2001).

3Le but du travail que nous présentons est, d’une part de définir des trajets de section, permettant d’exploiter les différents morphotypes de dents, en assurant quantitativement le prélèvement le plus efficace de pulpe dentaire et d’autre part, d’obtenir des échantillons non contaminés, en nous entourant lors du recueil des règles d’asepsie.

Matériel et méthode

Échantillons

Origine

4Les dents utilisées, au nombre de 23, pour mettre au point cette méthode, proviennent du dolmen de La Peyre, dont les fouilles ont été réalisées par B. Pajot (1994). Il s’agit de sépultures multiples dont le mobilier datable se rapporte pour l’essentiel à l’âge du cuivre soit à une période s’étendant de -3000 ans à -2300 ans av. J.-C.

Nature histologique des organes dentaires

5La pulpe est une masse conjonctivo-vasculaire, qui occupe la cavité centrale de la dent, elle produit et nourrit la dentine. Comme tout tissu conjonctif, la pulpe est formée de substance fondamentale (glycosaminoglycanes et glycoprotéines), de fibres de collagène et élastiques. La pulpe contient également des cellules : des fibroblastes, des fibrocytes, des cellules de défense, des cellules nerveuses et des odontoblastes.

6La dentine est un tissu minéralisé d’origine mésenchymateuse, elle est composée de 12 % d’eau, 18 % de matière organique et 70 % de minéraux. Ce tissu est en rapport avec le cément et l’émail à l’extérieur et la pulpe à l’intérieur, il n’est pas en contact avec le milieu extérieur. Sa dureté est supérieure à celle de l’os.

7L’émail est composé de 97 à 98 % de minéral. Il ne contient que 1 à 2 % de matière organique et 1 à 2 % d’eau, il est complètement acellulaire. Il recouvre la portion coronaire du complexe pulpo-dentinaire. Il s’agit du tissu le plus dur de l’organisme, du fait de sa composition minérale élevée. Pourtant, l’émail reste perméable, mais sa perméabilité diminue avec l’âge.

8La dent est ainsi un organe plus dense que l’os, tant au niveau minéral qu’organique. Cette particularité histologique protège l’ADN de la pulpe dentaire des contaminations. Dans cet organe, de l’ADN peut être mis en évidence dans la pulpe qui contient de nombreuses cellules et dans les tubulis dentinaires. En l’état actuel des connaissances, la mise en évidence d’ADN concerne la pulpe et l’extraction à partir de dents broyées. La dentine seule n’a pas été étudiée. Les améloblastes de l’émail ne contiennent pas d’ADN.

Méthode

9Notre méthode se décompose en deux temps, tout d’abord une incision de la dent, qui nous permet de la fragiliser, suivie d’une fracture. L’originalité de ce travail est la présentation de trajets d’incision adaptés à chaque morphoptype de dent et qui permettent d’accéder à la chambre et aux canaux pulpaires. Le temps nécessaire à la fracture de la dent et au prélèvement de la pulpe est d’environ 15 mn.

Matériel d’incision et de fracture des dents

10L’ensemble du matériel est stérile ou à usage unique : disques carbone, mandrins, pièce à main, syndesmotome droit, sonde (fig. 1).

Traitement des dents

11Les 23 dents qui composent l’échantillonnage ont été frottées avec une compresse stérile imprégnée d’eau bi-distillée, séchées, puis exposées sous UV pendant 30 mn sur chaque face.

Incision

12L’incision doit préfigurer le trait de fracture, elle permet l’accès le plus complet possible au réseau canalaire de la dent. Les tracés d’incision sont définis selon les différents morphotypes de dents : monoradiculées et pluriradiculées. L’incision est réalisée au moyen d’un disque carbone monté sur la pièce à main à l’aide du mandrin.

– Dents monoradiculées

13Il s’agit des incisives mandibulaires et maxillaires, des canines mandibulaires et maxillaires et des prémolaires mandibulaires. L’incision est réalisée sur les faces vestibulaire et palatine (ou linguale pour les dents mandibulaires). Le trait d’incision ne doit pas atteindre la cavité pulpaire.

Fig. 1 - Matériel utilisé pour l’incision et la fracture des dents.
Fig. 1 - Material used for the incision and fracture of teeth.

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– Dents biradiculées

14Pour les prémolaires supérieures, le tracé d’incision précédent est utilisé sur les faces vestibulaire et palatine.

– Dents pluriradiculées

15Les molaires maxillaires présentent trois racines, deux vestibulaires et une palatine ; une première incision vestibulaire passe entre les deux racines vestibulaires (fig. 2a) et vient entamer la racine palatine sur sa face vestibulaire, une deuxième incision est réalisée sur la face palatine (fig. 2b).

16Les molaires inférieures présentent deux racines, la racine mésiale comporte deux canaux pulpaires, une incision mésiale passe entre ces deux canaux puis intéresse la racine distale sur ses faces mésiale et distale (fig. 3).

Fig. 2a - Incision vestibulaire d’une molaire maxillaire.
Fig. 2a - Vestibular incision of a maxillary molar.

Image2

Fig. 2b - Incision palatine d’une molaire supérieure.
Fig. 2b - Palatal incisions of a maxillary molar

Image3

Fig. 3 - Incision de la racine mésiale d’une molaire mandibulaire sur la face mésiale, entre les deux canaux pulpaires.
Fig. 3 - Incision of the mesial root of a mandibular molar on the mesial face, between the two pulp canals.

Image4

La fracture

17Les dents sont fracturées à l’aide d’un syndesmotome droit placé dans le trait d’incision et en réalisant un petit mouvement de luxation. Une légère pression doit être exercée simultanément afin d’assurer le partage de la dent sur toute sa longueur (fig. 4).

Fig. 4 - Dents fracturées, exposition de la chambre pulpaire dans son plus grand volume.
Fig. 4 - Fractured teeth, exposure of the pulp chamber in its largest volume.

Image5

a) incisive
a) incisor

Image6

b) molaire maxillaire
b) maxillary molar

Image7

c) molaire mandibulaire
c) mandibular molar

Recueil de la pulpe dentaire

18La dent sectionnée est maintenue au-dessus d’un tube stérile. Les restes de pulpe dentaire sont recueillis à l’aide d’une sonde. La substance ainsi détachée des parois de la chambre pulpaire tombe directement dans le tube. En moyenne, nous avons récupéré 7,64 mg de poudre par dent. La sonde est un outil préférable à la curette, instrument pour lequel nous avions opté en premier lieu. La sonde, en effet, par son extrémité fine nous permet d’accéder aux anfractuosités camérales.

Discussion

19L’étude de l’ADN ancien à partir d’échantillons de pulpe dentaire fait appel à différents types de préparations. Une des techniques repose sur les principes de l’endodontie (Garcia et al., 1996), la dent est trépanée au niveau de la couronne jusqu’à la pulpe, qui est recueillie à l’aide de racleurs. Les deux méthodes le plus souvent décrites dans la littérature pour recueillir les échantillons d’ADN pulpaire sont les dents broyées ou les dents sectionnées. Lors d’études de dents broyées, de l’ADN mitochondrial (Hänni et al., 1990 ; Di Benedetto et al., 2000 ; Baker et al., 2001) et de l’ADN nucléaire (Burger et al., 1999 ;  Hummel et al., 1999 ; Pfeiffer et al., 1999) sont mis en évidence. L’étude de dents sectionnées consiste en la fracture des dents, soit de façon longitudinale (Garcia et al., 1996 ; Drancourt et al., 1998 ; Raoult et al., 2000), soit selon un trait de fracture passant entre la couronne et la racine, le but étant de récupérer les restes de pulpe dentaire plus riches en cellules (Woodward et al., 1994). D’après Garcia et al. (1996), la section des dents offre de meilleurs résultats, il s’agit de la méthode de choix si l’anatomie de la dent est préservée. L’accès à la chambre et aux canaux pulpaires par une fracture nette relève de l’acquisition de la maîtrise du geste en plaçant le syndesmotome dans le trait d’incision ; la difficulté allant croissant des dents monoradiculées aux pluriradiculées, tel que les molaires supérieures. Par ailleurs, les dents destinées à l’analyse de l’ADN doivent encore être sur la mâchoire, et extraites aseptiquement ; l’apex des racines expose la dent libre aux risques de contaminations. Les caries et les microfractures sont autant de facteurs de risques.

20Le degré de dégradation de l’ADN en fonction des facteurs extérieurs sur des périodes allant de T0 à cinquante ans dépend de paramètres tels que : le temps, le pH, l’humidité, le terrain, les micro-organismes, la température (Schwartz et al., 1991 ; Garcia et al., 1996 ; Baker et al., 2001). Il semble que les dents fournissent une excellente protection à l’ADN quelles que soient les conditions de conservation des échantillons, avec une légère augmentation de la dégradation de l’ADN pour les échantillons conservés dans l’eau (dilution, augmentation de l’hydrolyse) (Schwartz et al., 1991 ; Garcia et al., 1996 ). Toutefois, il est possible d’extraire de l’ADN même après incinération sévère, ce qui s’avère impossible au niveau osseux (Baker et al., 2001). Il est à noter que les résultats varient plus en fonction des locus étudiés que des conditions environnementales, ainsi ils sont mauvais pour le locus D1S80 (580 paires de bases) (Garcia et al., 1996), mais dans l’ensemble, l’étude des locus STR donne d’excellents résultats. Les meilleurs résultats sont obtenus pour les dents encore présentes dans les maxillaires, l’os offrant une protection au foramen apical (Garcia et al., 1996). La qualité des séquences obtenues n’est pas fonction du morphotype des dents étudiées (Baker et al., 2001). Les résultats paraissent influencés par différents paramètres, le volume pulpaire, l’âge au décès de l’individu et les antécédents pathologiques dentaires (Garcia et al., 1996).

21La maîtrise de la méthode de fracture des dents nous a permis de mettre en évidence de l’ADN dans la pulpe dentaire d’échantillons provenant de sépultures multiples du xie auxve du site de Saint Côme et de Saint Damien à Montpellier. Les premiers résultats que nous avons obtenus concernent les loci STR : D21S11, D3S1358, V WA, FGA, D7S820 et l’amélogénine du Kit AmpF-STR® Profiler PlusTM, de Perking Elmer ; ils mettent en évidence la difficulté d’amplifier l’ADN ancien par PCR en raison de la présence d’inhibiteurs (Calvo et al., 2002). La technique d’incision des dents que nous avons mise au point ne nous permet pas de noter de différences, quant à la qualité des fractures obtenues, en fonction de l’origine des échantillons traités.

À toute l’équipe du professeur B. Ludes (Laboratoire d’Anthropologie moléculaire de l’Institut de médecine légale de Strasbourg),  Mme M. Defais et Mme C. Lesca (IPBS-CNRS, Toulouse) et à Mme S. Duchenne (UMR 8555 du CNRS, Toulouse).

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Pour citer cet article

Référence électronique

A.-M. Grimoud, C. Keyser, L. Calvo et B. Pajot, « Schémas d’incisions et de fracture des différents morphotypes de dents adaptés au recueil de pulpes dentaires et à l’analyse d’ADN », Bulletins et mémoires de la Société d’Anthropologie de Paris [En ligne], 14 (1-2) | 2002, mis en ligne le 23 avril 2010, consulté le 23 mai 2017. URL : http://bmsap.revues.org/109

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Auteurs

A.-M. Grimoud

UMR 8555 du CNRS, 37 allées Jules Guesde, 31073 Toulouse Cedex, e-mail : Annemarie.Grimoud@wanadoo.fr

C. Keyser

Institut de Médecine Légale, Laboratoire de biologie moléculaire de l’ADN ancien, Faculté de Médecine, 7  rue Ulmann, 67000 Strasbourg.

L. Calvo

UMR 8555 du CNRS, 37 allées Jules Guesde, 31073 Toulouse Cedex.

B. Pajot

UMR 8555 du CNRS, 37 allées Jules Guesde, 31073 Toulouse Cedex.

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Droits d’auteur

© Société d’anthropologie de Paris

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